自噬（Autophagy），是指溶酶體中的水解酶非特異地降解細胞質中蛋白質、細胞器等底物的過程，它同時還受複雜信號精細調控，研究比較清楚的有PI3K-I和PI3K-III、mTOR等。 自噬過程一般分爲三個階段： 自噬起始階段、自噬小體形成階段、自噬溶酶體階段。它參與着腫瘤、衰老、炎症、免疫應答、心腦血管疾病、氧化應激、神經退行性疾病、代謝、發育等重要生物學過程。 自噬研究的切入角度： 通常除了研究自噬本身，更多的是把自噬作爲一個機制來研究，如自噬如何參與腫瘤的發生發展、自噬如何參與腫瘤的耐藥性、自噬如何參與炎症反應、自噬如何參與氧化應激、甚至自噬如何參與自閉症、阿爾茲海默症的發生與治療等

調控自噬的主要信號通路和相關基因

1、LC3剪切的變化

2、電鏡直接觀察到自噬囊泡

3、荧光蛋白標記的LC3檢測自噬流

衡量自噬的三個“黃金標准”，分別是LC3的翻譯後加工及脂化修飾（圖A）、利用電鏡直接觀察自噬小體和自噬溶酶體的多少、荧光蛋白標記的LC3監測自噬流（圖B）。

主流自噬示蹤工具一：mRFP-GFP-LC3 自噬雙標腺病毒（現爲mCherry-eGFP-LC3）

雙荧光指示體系原理

mRFP 用于標記及追蹤LC3，GFP 的減弱可指示溶酶體與自噬小體的融合形成自噬溶酶體，即由于GFP 荧光蛋白對酸性敏感，當自噬體與溶酶體融合後GFP 荧光發生淬滅,此時只能檢測到紅色荧光。

我們在顯微鏡成像後紅綠荧光merge後通過merge後出現的黃色斑點即只是自噬體.紅色的斑點指示自噬溶酶體,通過不同顔色斑點的計數可以清晰的看出自噬流的強弱。

如下圖:細胞轉染mRFP-GFP-LC3病毒後給予氨基酸剝奪處理2小時後出現明顯增強的自噬以及自噬流。

紅色且沒有綠色的斑點代表自噬溶酶體（mRFP），黃色斑點代表自噬小體（RFP+GFP），（由于GFP 荧光蛋白對酸性敏感，當自噬體與溶酶體融合後GFP 荧光發生淬滅,此時只能檢測到紅色荧光）

Fusobacterium nucleatum Promotes Chemoresistance to Colorectal Cancer by Modulating Autophagy. 

漢恒客戶2017年發表于CELL，IF>30.

主流定位示蹤工具二：p62

U2OS用GFP-p62和LC3-RFP同時標記。然後用60 μM 氯喹處理16hr。可以觀察到二者有着明顯的共定位。（當誘導自噬時，GFP-p62融合蛋白被招募到自噬小體上，呈現綠色小點。如果此時加入氯喹抑制自噬流， 那麽GFP-p62就會累積在自噬小體和自噬溶酶體上）

選擇性自噬定位工具: Keima探針

Keima探針研究核糖體選擇性自噬的基本原理