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轉染試劑系列

Transfection Reagent

細胞轉染實驗即將外源分子如DNA，RNA等導入真核細胞的技術，是分子生物和細胞生物學最常見的實驗技術。將外源DNA 導入哺乳動物細胞的方法大致可分爲兩大類，即生物方法和物理化學方法。物理化學方法中常用的有磷酸鈣法、顯微注射、電穿孔、脂質體介導的轉染，以及最近出現的以高分子聚合物爲載體的基因傳遞技術。生物方法則主要是以病毒作爲載體,通過病毒感染的方式將外源DNA 導入到細胞中, 其中以慢病毒及腺病毒轉染系統最爲常用。

漢恒生物提供用于 DNA、siRNA、RNA 遞送的多種轉染試劑。

漢恒轉染試劑特點：

高效性

轉染效率高，適用于大多細胞系

低毒性

轉染的細胞仍保持很好的活性

廣普性

普通細胞、難轉染的原代細胞全面覆盖

細胞轉染試劑当前產品列表：

当前產品貨號	当前產品名稱	当前產品規格	適用範圍
HB-LF-1000	LipoFiter轉染試劑	1mL	適用于普通細胞系轉染，低細胞毒性
HB-LF3-1000	LipoFiter 3.0高效轉染試劑	1mL	適用于普通細胞系和難轉染細胞系，轉染效率高
HB-RF-1000	RNA轉染試劑RNAFit	1mL	適用于小RNA轉染
HB-LLF-1000	LentiFit慢病毒包裝專用轉染試劑	1mL	適用于慢病毒包裝共轉染慢病毒質粒系統

細胞轉染方法比較：

轉染方法	原理	應用	特點
脂質體轉染	陽離子脂質體表面帶正電荷，能與核酸的磷酸根通過靜電作用，將DNA分子包裹入內，形成DNA脂複合物，也能被表面帶負電的細胞膜吸附，再通過融合或細胞內吞進入細胞	瞬轉/穩轉	實驗操作簡單，重複性高，細胞毒性低，適用性廣
磷酸鈣法	磷酸鈣DNA複合物吸附細胞膜被細胞內吞	瞬轉/穩轉	實驗條件控制嚴格，難度較大，且不適用于原代細胞
病毒轉染	利用病毒攜帶目的基因片段，感染目的細胞，主要有慢病毒、腺病毒和腺相關病毒	瞬轉/穩轉	轉染效率高，可用于難轉染的細胞及原代、懸浮細胞，病毒包裝難度較大
電穿孔法	電流能夠可逆地擊穿細胞膜形成瞬時的水通路或膜上小孔促使DNA分子進入胞內	瞬轉	適用性廣，但細胞致死率高，DNA和細胞用量大
顯微注射	使用一根超細的針頭講DNA,RNA或蛋白直接注入細胞質或細胞核	瞬轉/穩轉	適用這種方法的細胞不多，技術複雜設備昂貴

常見問題

細胞轉染試劑怎麽選？

我們公司有各種不同的轉染試劑可供大家實驗需求。針對siRNA的轉染可以選擇RNA專用轉染試劑RNAFit。針對質粒DNA的轉染可以選擇LipoFiter轉染試劑，改轉染試劑適用于普通細胞系轉染，具有低細胞毒性的特點。高級版的LipoFiter 3.0高效轉染試劑，適用于普通細胞系和難轉染細胞系，具有極高的轉染效率。如果有慢病毒包裝的實驗需求，可以選擇LentiFit慢病毒包裝專用轉染試劑，配合我們的慢病毒包裝系統，可以獲得高滴度的病毒液。

轉染前細胞需要怎樣的狀態和密度呢？

細胞的生長狀態會直接影響轉染效果。轉染前細胞最好經過1-2次傳代，細胞良好的生長狀態有助于提高轉染效率。有些細胞系傳代很多次還能夠保證很高的轉染效率，而其他一些細胞系則傳代很少次數轉染效率就有顯着降低，值得注意的是，貼璧細胞一旦長滿就不容易轉染了。用于轉染的細胞密度根據不同的細胞類型而異。細胞密度對轉染效率的影響比較大。一般在轉染時，貼璧細胞密度50%~70%爲宜，懸浮細胞密度爲2x 10^6--4x 10^6細胞/ml時效果較好。鋪板細胞數目的增加可以增加轉染活性和細胞產量，對于轉染siRNA確保接種貼璧細胞密度在30%-50%左右，懸浮細胞密度爲5x 10^5--1x 10^6細胞/ml，對于一些生長緩慢的細胞，接種密度可適當擴大2倍。

轉染時是否需要使用無血清、雙抗的培養基？

血清一度曾被認爲會降低轉染效率，在開始准備DNA和陽離子脂質體試劑稀釋液時要使用無血清的培養基。血清中含有大量的蛋白質，在轉染過程中，帶負電的蛋白質可能幹擾陽離子脂質體/陽離子聚合物對核酸的吸附，影響轉染效率。但在複合物形成後，在加入細胞中前可以加入血清。當然，最好是按照轉染試劑說明書的要求來進行操作。雙抗一般對于真核細胞無毒，但陽離子脂質體試劑增加了細胞的通透性，使雙抗可以進入細胞。這降低了細胞的活性，導致轉染效率低。所以，在轉染培養基中不能使用雙抗，甚至在准備轉染前進行細胞鋪板時也要避免使用雙抗。

轉染效率低的原因是什麽呢？

影響轉染效率的因素主要有以下幾點；細胞因素，細胞的狀態對轉染效率的影響較大。要確保細胞未被汙染以及細胞處在對數期。如果是貼壁細胞的話，貼壁率應該在50%~70%。轉染時細胞密度過高或者過低都會導致轉染效率降低，乃至表達水平偏低。核酸因素，轉染載體的質量也影響轉染結果。如果DNA 不純，OD260/OD280<1.6，表示存在蛋白或者酚類汙染，會影響核酸-轉染試劑複合物的形成，從而降低質粒的轉染效率。質粒抽提過程中如果存在內毒素會影響到細胞狀態甚至導致細胞死亡，建議用無內毒素質粒抽提試劑盒進行質粒提取。轉染條件，是否是最優轉染條件進行轉染。正式實驗前，一般需要根據說明書，設置一系列梯度對核酸/轉染試劑比例進行摸索，選擇最佳組合作爲後續轉染條件。

轉染後出現細胞死亡是什麽原因？

可能是細胞本身狀態差，在進行轉染實驗刺激後也可能導致細胞死亡。應該在轉染前調整好細胞狀態，在轉染實驗過程中操作盡可能小心，減少實驗操作對細胞造成不必要的損傷。用于轉染的質粒DNA如果不純，比如含有蛋白質、酚等汙染，在進行細胞轉染過程中進入細胞後也會影響到細胞的生長狀態甚至導致細胞死亡。如果轉染用的質粒含有內毒素，也會對細胞造成較大的毒性。

應用案例参考：

客戶案例参考1：

中國農業大學客戶發表于Molecular Cancer，IF=41.444

文章標題：A novel polypeptide encoded by the circular RNA ZKSCAN1 suppresses HCC via degradation of mTOR

使用方法：LipoFiter 3.0轉染質粒

細胞轉染試劑

文章figure2 circZKSCAN1編碼一個206aa的多肽

客戶案例参考2：

江蘇大學醫學院客戶發表于Molecular Cancer，IF=41.444

文章標題：Tumor-derived exosomes induce N2 polarization of neutrophils to promote gastric cancer cell migration

使用方法：LipoFiter轉染siRNA到BGC-823細胞

文章figure7 HMGB1在胃癌細胞中被沉默 siRNA

感染效果：

客戶發表文獻節選：

Tumor-derived exosomes induce N2 polarization of neutrophils to promote gastric cancer cell migration

（雜志:Molecular Cancer，IF=27.401，江蘇大學醫學院）

Low expression of TRAF3IP2-AS1 promotes progression of NONO-TFE3 translocation renal cell carcinoma by stimulating N6-methyladenosine of PARP1 mRNA and downregulating PTEN

（雜志:Journal of Hematology and Oncology，IF=17.384，南京大學）

Switch receptor T3/28 improves long-term persistence and antitumor efficacy of CAR-T cells

（雜志:Journal for ImmunoTherapy of Cancer，IF=13.751，山東大學）

Positive natural selection of N6-methyladenosine on the RNAs of processed pseudogenes

（雜志:Genome Biology，IF=13.583，中山大學）

TRIM24 facilitates antiviral immunity through mediating K63-linked TRAF3 ubiquitination

（雜志:Journal of Experimental Medicine，IF=11.743，中國科學院上海營養健康研究所）

Targeting miR-21 with NL101 blocks c-Myc/Mxd1 loop and inhibits the growth of B cell lymphoma

（雜志:Theranostics，IF=11.556，浙江大學醫學院第二附屬醫院）

Tubular epithelial cell-to-macrophage communicationforms a negative feedback loop via extracellular vesicletransfer to promote renal inflammation and apoptosis indiabetic nephropathy

（雜志:Theranostics，IF=11.556，安徽醫科大學）

N6-methyladenosine-induced circ1662 promotes metastasis of colorectal cancer by accelerating YAP1 nuclear localization

（雜志:Theranostics，IF=11.556，鄭州大學第一附屬醫院）

Tubular-specific CDK12 knockout causes a defect in urine concentration due to premature cleavage of the slc12a1 gene

（雜志:Molecular Therapy，IF=11.454，東南大學醫學院中大醫院）

A novel epigenetic AML1‐ETO/THAP10/miR‐383 mini‐circuitry contributes to t(8;21) leukaemogenesis

（雜志:EMBO Molecular Medicine，IF=10.624，中國人民解放軍總醫院）