非編碼RNA幹貨-circRNA的調控

上一期幹貨內容針對lncRNA進行了詳細的介紹，本期繼續爲大家介紹既是功能性RNA分子，部分也具有編碼蛋白能力的另一類非編碼RNA，即本期的主角—circular RNAs（circRNAs）。

circRNAs是一類單鏈環狀的非編碼RNA，在病毒、植物和哺乳動物等各物種中廣泛表達。區別于傳統的線性RNA，circRNA不具有5‘帽子結構和3‘ poly(A)尾，並以共價鍵的形式閉合成環，對核酸外切酶不敏感，這種獨特的結構賦予了circRNA高度的穩定性。

起初發現的少量circRNA，被認爲是基因轉錄剪切過程中因剪接錯誤產生的一些副產物，不確定在生物學過程中是否發揮重要作用。隨着高通量測序技術的應用發展，人們發現哺乳動物細胞中存在大量的circRNA。直到2013年，Nature雜志的兩篇研究論文取得了突破性研究進展，首次證明circRNA可以通過充當miRNA海綿，參與基因表達調控而發揮生物學功能，進而迅速成爲生物醫學研究領域的焦點。我們本期將從circRNA分類及成環機制、circRNA生物學功能、circRNA常規研究思路及方法和常用數據庫等方面帶大家具體了解一下circRNA的“神秘”。

一、circRNA分類及成環機制

RNA的選擇性剪接是真核細胞中基因轉錄表達過程的重要事件。mRNA前體經過剪接後將內含子去除，使外顯子依次連接或跳躍式連接產生成熟的mRNA。CircRNA是mRNA前體經反向剪接產生，由下遊剪接受體與上遊剪接供體連接形成共價閉環結構。隨後，主要可產生三種類型的circRNA：

圖1. circRNA成環機制示意圖^[1]

（BP：branch point，分支點；SA：splice-acceptor，剪接受體；SD：splice-donor，剪接供體；BSJ：backsplice junction，反向連接點）

1、由外顯子構成的circRNA（exonic circRNA，EcircRNA）

目前研究認爲EcircRNA有兩種形成方式：套索驅動環化，內含子配對驅動環化。

① 套索驅動環化：這種環化方式是mRNA前體首先經過經典剪接作用和外顯子跳讀，生成具有多個外顯子且包含內含子套索的線性RNA，然後經反向剪接，即內含子套索下遊3’端的剪接受體與上遊5’端的剪接供體連接成環，並將內含子切除後形成成熟的circRNA。

② 內含子驅動環化：內含子驅動環化也有兩種方式。一是依賴外顯子兩端的內含子中具有一定長度的互補序列，經互補配對後，拉近了兩端的剪接受體和剪接供體，此時內含子被切除，脫落的外顯子連接成環；這是促進外顯子環化的有效方法，短散在重複序列（SINE）家族成員Alu元件已明確是可促進circRNA成環，且已作爲成環元件廣泛應用于外源性表達circRNA。二是通過RNA結合蛋白（RBP）驅動環化，當外顯子兩端的內含子序列具有RBP結合位點時，RBP與之結合後形成二聚體，使兩個剪接位點靠近，從而促進環化。

2、由內含子構成的circRNA（intronic circRNA，ciRNA）

ciRNA的形成過程與EcircRNA不同。正常情況下，經典剪接過程中釋放的內含子套索會被降解；然而當其5’端剪接位點包含一段7nt富含GU堿基的序列以及3’端附近含有11nt富含C堿基的序列，使內含子套索受到保護，即會形成ciRNA。

3、外顯子和內含子組合形成的circRNA（exon-intron circRNA，EIciRNA）

事實上，套索驅動和內含子驅動環化不僅可以產生EcircRNA，也可能會產生EIciRNA。

除此之外，tRNA和病毒RNA等也可環化產生circRNA。

二、circRNA生物學功能

從“垃圾”到明星分子，circRNA的功能得到不斷發掘，circRNA不僅具有調控功能，部分還有其獨特的翻譯能力，且廣泛參與機體的生理和病理機制。

圖2. circRNA功能示意圖^[2]

1、充當miRNA海綿

起初觀察到一些circRNA有許多miRNA結合位點，後來大量研究證實了這一點。位于細胞質中的circRNA可以充當競爭性內源RNA（ceRNA），吸附miRNA發揮生物學功能。

2、circRNA翻譯功能

真核細胞中mRNA通過5’端帽子結構附着到核糖體上，最終翻譯出多肽。circRNA缺乏5’帽子，無法依賴這種方式進行啓動翻譯，但是含有內部核糖體進入位點（IRES）的circRNA可以直接募集核糖體並起始翻譯，此類circRNA需同時擁有開放閱讀框（ORF）且位于IRES下遊。

3、轉錄調控功能

circRNA可以通過與相應DNA位點結合形成RNA－DNA雜交鏈或R環，導致結合處無法轉錄，發生外顯子跳躍或轉錄終止，進而產生新的剪切體。另一方面，circRNA也可與轉錄因子相互作用以調節基因轉錄。

4、circRNA與蛋白質相互作用

除上述功能外，circRNA還可以與一種或多種蛋白相互作用，充當蛋白誘饵、支架或募集劑。具體而言，circRNA與蛋白結合可能產生多方面的影響：

① 改變蛋白間或蛋白與核酸分子的相互作用：一種模式是circRNA同時與兩種蛋白相互作用，促進或解離這兩種蛋白的互作；另一種模式是circRNA通過與一種蛋白相互作用，來影響該蛋白與另一蛋白的互作；還有一種則是circRNA只與一種蛋白結合，使其功能喪失或產生新的功能。

② 募集蛋白到染色質中：circRNA與順式作用元件結合並招募轉錄因子或表觀遺傳修飾酶等，進而改變基因表達。

③ 改變蛋白的核內外分布：核定位或胞質中可入核的circRNA可促進蛋白的核易位，胞質定位或核內可輸出到胞質中的circRNA則促進蛋白的胞質易位；此外還有部分可轉運至膜或線粒體等。

三、circRNA常規研究思路及方法

從上一小節可知，目前發現circRNA發揮作用的功能機制分類繁雜，其中以ceRNA相關機制研究爲主。這裏總結了circRNA的一般研究思路尤其是ceRNA機制，以及對應的一些研究方法，供大家參考（圖3）。

值得注意的是，與普通線性基因不同，circRNA的表達調控有其特別之處。

（1）circRNA過表達：內源性circRNA之所以能閉合成環，是因爲circRNA序列外顯子兩側的長側翼內含子具有成環元件（如Alu），能夠促進線性序列成環。因此使用質粒或病毒載體進行外源性表達，同樣需要在circRNA序列兩端加上成環元件，以確保序列成環。

（PS：漢恒生物circRNA成環載體系統可達到100%成環哦，且體內和體外實驗均適用。）

（2）circRNA幹擾：siRNA或shRNA即可用于敲低circRNA，但爲避免幹擾到其母本基因或線性序列的表達，需針對circRNA的接點處設計幹擾靶點。

（3）circRNA敲除：使用CRISPR-Cas9技術敲除circRNA。考慮可能會影響到親本基因的表達，一般是不會直接敲除circRNA的片段。通常采取敲除circRNA的成環元件Alu的方式，破環其成環能力，即針對circRNA兩端長側翼內含子中的Alu序列設計雙gRNA進行敲除，此法難點在于內含子中可能存在不止一個Alu元件，需從中找出催化成環對應的序列。

圖3. circRNA研究思路及相關方法

四、常用數據庫

要想研究circRNA機制，通過數據庫進行信息查詢或預測相關功能是必不可少的，下面是一些circRNA研究常用到的數據庫，可以查詢circRNA的基本信息、互作靶點、與之相關疾病以及預測編碼能力等（表1）。

表1. circRNA常用數據庫彙總

本期內容從circRNA的分類、成環機制、主要生物學功能、研究思路及方法這幾個方面進行了具體介紹，希望能幫助到想入門研究circRNA或涉及相關研究方向的小夥伴，有興趣可以根據這些知識點深入拓展哦~另外，漢恒生物可以提供circRNA過表達、幹擾和敲除載體的構建、與靶基因互作的雙荧光素酶驗證服務等，並擁有專業的技術服務團隊爲您答疑解惑，有意向的小夥伴歡迎與我們聯系~下期我們將繼續介紹另一種重要的非編碼RNA—microRNA，敬請關注！

參考文獻：

[1] Kristensen LS, Andersen MS, Stagsted LVW, Ebbesen KK, Hansen TB, Kjems J. The biogenesis, biology and characterization of circular RNAs. Nat Rev Genet. 2019 Nov;20(11):675-691. doi: 10.1038/s41576-019-0158-7.

[2] Li R, Jiang J, Shi H, Qian H, Zhang X, Xu W. CircRNA: a rising star in gastric cancer. Cell Mol Life Sci. 2020 May;77(9):1661-1680. doi: 10.1007/s00018-019-03345-5.