Bone Reaserch丨關節炎早期幹預新策略——LATS1-ZBTB20軸如何成爲軟骨救星

骨關節炎（Osteoarthritis，OA）是一種常見的慢性關節疾病，其病理變化包括關節軟骨的顫動和退化、軟骨下骨硬化、骨赘的形成以及炎症反應。目前，藥物治療以緩解疼痛爲主，暫無改善疾病的治療方法。因此，識別和定義OA早期階段的細胞和分子級聯反應將有利于OA初始階段的診斷和治療，最終促進關節穩態的恢複。ZBTB20作爲ZBTB蛋白家族成員，具有轉錄抑制作用，參與器官發育及代謝調控，其在關節軟骨中通過抑制Sox9調節肥厚性軟骨細胞的終末分化。然而，ZBTB20在OA病理發展中的功能仍不清楚。

西安交通大學及西北大學颉強團隊、第四軍醫大學楊柳團隊聯合在Bone Reaserch（IF:14.3）上發表研究論文《LATS1-modulated ZBTB20 perturbing cartilage matrix homeostasis contributes to early-stage osteoarthritis》，發現ZBTB20在OA早期易位至細胞核，其核內聚集水平隨着病程發展逐漸減弱；ZBTB20通過抑制Pten表達，激活PI3K-Akt-NF-κB信號來破壞細胞外基質（ECM）的代謝平衡；此外，ZBTB20的亞細胞定位和轉錄活性可被上遊調控因子LATS1調節，應用LATS1抑制劑TRULI和SGLT2抑制劑DAPA幹預可有效逆轉由ZBTB20介導的ECM代謝紊亂，緩解OA發展和軟骨退化。在本研究中，作者使用漢恒生物提供的cre過表達重組腺病毒Ad-Cre-GFP實現了Zbtb20fl/fl小鼠原代軟骨細胞的Zbtb20基因敲除、Zbtb20過表達重組腺病毒Ad-mZbtb20-GFP感染野生型原代軟骨細胞實現了Zbtb20的外源性過表達。

接下來，我們一起看看本研究的主要結果。

首先，作者使用白細胞介素-1β（IL-1β）處理原代軟骨細胞建立了體外炎症模型，選取0、6 h（快速反應）、48 h（長期反應）時間點進行轉錄組測序（RNA-seq）和染色質可及性分析（ATAC-seq）。對各組中TF結合基序的分析結果顯示，6 h組富集了具有鋅指結構域的轉錄因子，提示鋅指蛋白被激活。單細胞測序結果顯示鋅指蛋白ZBTB20這一具有炎症反應調節功能的基因在軟骨細胞簇中顯著表達。作者通過小鼠內側半月板失穩（DMM）手術構建OA模型，對關節軟骨切片進行免疫荧光染色，證實了術後2周軟骨細胞中的ZBTB20發生核轉位，隨着病程發展核轉位逐漸減少，這一變化與COLII相關。在體外培養的軟骨細胞中，ZBTB20的蛋白水平在IL-1β刺激後表現出下調趨勢。爲了排除個體異質性幹擾，作者使用同一OA患者胫骨平台兩側的軟骨進行對比，免疫組化結果顯示受損區域ZBTB20的表達顯著降低。這表明ZBTB20的激活與OA早期的發病機制之間存在強相關性。

圖1 轉錄因子ZBTB20在OA早期被激活

爲進一步探究ZBTB20在OA病理進程中的功能，作者使用野生型和誘導型軟骨特異性ZBTB20敲除小鼠構建OA模型。他莫昔芬注射2周後進行內側半月板失穩（DMM）手術，組織學分析顯示野生型小鼠OA模型組增生性軟骨細胞數量的增加、OARSI評分升高、骨赘體積和軟骨下骨板厚度的增加，提示模型建立成功，而Zbtb20敲除減輕了這些症狀。ECM合成代謝和分解代謝的不平衡是軟骨退化的主要原因，因此，作者檢查了參與ECM穩態的蛋白的表達。免疫荧光染色結果顯示Zbtb20敲除可顯著恢複由DMM手術所引起的軟骨ECM成分（COL II和ACAN）的減少，以及ECM降解酶（MMP13和ADAMTS5）的異常表達。此外，使用Cre腺病毒在Zbtb20f/f小鼠分離培養的軟骨細胞中敲除Zbtb20抑制了IL-1β誘導的ECM穩態破壞，包括抑制MMP3、MMP13、ADAMTS5的異常上調和COL II的異常下調，而Zbtb20過表達則加劇了穩態的破壞。這些發現共同表明ZBTB20可通過破壞ECM穩態來加速OA疾病發展。

圖2 ZBTB20的下調減弱OA發展

在前期實驗中，作者發現NF-κB信號在IL-1β處理的軟骨細胞中特異性上調，且Zbtb20缺失抑制了NF-κB信號激活，這表明ZBTB20可能觸發了NF-κB信號傳導。爲了闡明ZBTB20激活NF-κB信號的潛在方式，作者對比WT和Zbtb20敲除軟骨細胞的轉錄組差異，結果顯示差異基因在PI3K-Akt信號通路中高度富集，WB結果顯示IL-1β處理和過表達Zbtb20均可顯著上調AKT蛋白磷酸化水平，而敲除Zbtb20抑制了IL-1β誘導的AKT蛋白磷酸化水平上升，這一結果提示PI3K-Akt信號是ZBTB20的下遊效應通路。通過CUT&Tag-seq和ChIP-qPCR分析，作者發現Pten基因是ZBTB20與PI3K-Akt信號通路之間的關鍵調控因子，ZBTB20可與Pten的啓動子區域結合。Zbtb20過表達或敲除的軟骨細胞中的功能實驗顯示，PTEN表達變化與p65（NF-κB亞基）磷酸化呈負相關，進一步表明了ZBTB20對PTEN的抑制作用。此外，RT-qPCR的結果顯示在IL-1β誘導的軟骨細胞中，SC79（PI3K-Akt信號激活劑）破壞了Zbtb20敲除介導的ECM穩態恢複，MK2206（PI3K-Akt信號抑制劑）則恢複了Zbtb20過表達誘導的ECM穩態失衡。這些結果表明NF-κB介導的ZBTB20對ECM穩態的幹擾需要ZBTB20抑制Pten表達，激活下遊PI3K-Akt信號。

圖3 ZBTB20通過抑制Pten激活NF-κB信號

研究團隊在觀察ZBTB20細胞亞定位時發現，軟骨細胞中ZBTB20的細胞核積累以IL-1β劑量依賴性增加。基于果蝇研究中Warts激酶（又稱LATS1）直接與ZBTB20同源物Lola相互作用的機制基礎，作者探索了LATS1對ZBTB20的調控作用。WB結果顯示IL-1β處理的軟骨細胞以及DMM誘導的OA軟骨中LATS1的磷酸化修飾增加；使用Flag-ZBTB20/Myc-LATS1共轉染的Co-IP實驗和TurboID臨近標記技術的結果均驗證了ZBTB20和LATS1之間存在相互作用，並且該作用可被IL-1β抑制。此外，TRULI（LATS1/2抑制劑，可抑制LATS1磷酸化）可抑制IL-1β誘導的ZBTB20細胞核積聚。這些結果共同揭示了，激酶LATS1可被IL-1β誘導磷酸化，通過減弱與ZBTB20的相互作用，進而驅動ZBTB20核易位以執行轉錄調控功能。

圖4 LATS1調控ZBTB20的細胞亞定位

接下來，作者評估了靶向幹預策略恢複ECM平衡的可行性。結果表明，TRULI在IL-1β誘導刺激下以劑量依賴的方式恢複了的ECM的合成、阻斷了ECM的降解。另一種潛在的Zbtb20治療藥物達格列淨（DAPA）可在IL-1β處理的軟骨細胞中抑制Zbtb20表達，上調PTEN表達，並以劑量依賴性方式恢複ECM平衡。免疫荧光與WB分析證實，TRULI和DAPA抑制了IL-1β誘導的p65核轉位。綜上所述，靶向LATS1-ZBTB20信號軸或直接抑制ZBTB20表達的兩種獨立策略均可通過觸發NF-κB信號傳導，恢複ECM穩態。

圖5 TRULI和DAPA恢複軟骨細胞的ECM穩態

前期研究已經證實DMM術後兩周是OA發病機制的關鍵階段，在此期間LATS1磷酸化，引起ZBTB20發生核轉位。爲了評估TRULI和DAPA在體內的潛在保護能力，作者評估了手術後立即給藥和手術後2周給藥的小鼠行爲和組織病理變化。行爲學結果顯示，DMM手術導致小鼠腿部的絕對爪角增加、爪面積減少、站立時間縮短和擺動時間延長，手術後立即或2周後使用TRULI或DAPA可改善異常行爲；在病理上，給藥組的軟骨基質丟失和軟骨外圍侵蝕均得到改善。在體外培養人軟骨外植體的研究中，番紅O（Safranin O）染色結果顯示：TRULI或DAPA可顯著且劑量依賴性地改善由IL-1β導致的蛋白多糖表面侵蝕和丟失；二甲基亞甲基藍（DMMB）測定結果顯示：藥物組中軟骨的糖胺聚糖（GAG）釋放被顯著抑制。最後，作者對原代軟骨細胞進行了RNA-seq分析，發現TRULI和DAPA治療可抑制多種炎症相關的通路：TRULI主要影響細胞周期調控通路，而DAPA主要靶向蛋白聚糖和ECM受體相互作用。這些發現表明TRULI和DAPA可通過不同機制緩解OA發展。

圖6 TRULI和DAPA均可緩解OA病程發展

綜上所述，本研究探索了轉錄因子ZBTB20對早期OA炎症反應和ECM穩態的關鍵作用，發現ZBTB20通過抑制Pten激活PI3K-Akt信號通路，進而激活NF-κB信號，破壞ECM穩態，而激酶LATS1通過磷酸化調控ZBTB20的亞細胞定位，促使其入核激活下遊炎症通路。研究還證明小分子化合物TRULI和DAPA可調控ZBTB20可恢複ECM穩態，改善OA症狀，這發現提出了以LATS1或ZBTB20爲靶點早期OA的診斷和治療提供了新靶點和潛在藥物。